反相高效液相色谱柱采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带人色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
反相高效液相色谱柱按溶质在两相分离过程的物理化学原理分类：
(1)吸附色谱
用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
(2)分配色谱
用载带在固相基体上的固定液作固定相，以不同极性溶剂作流动相，依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。根据固定相和液体流动相相对极性的差别，又可分为正相分配色谱和反相分配色谱。
(3)离子色谱
用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定pH值的缓冲溶液作流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆性离子交换能力的差别而实现分离。
(4)体积排阻色谱
用化学惰性的多孔性凝胶作固定相，按固定相对样品中各组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
(5)亲和色谱
以在不同基体上，键合多种不同特性的配位体作固定相，用具有不同pH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子(氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸、酶等)与基体上键联的配位体之间存在特异性亲和作用能力的差别，而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
