高效液相色谱柱是消耗品，会随使用时间或进样的次数增加，出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰，柱效下降。需要定期进行清洗和再生，不同的色谱柱清洗方法各不相同比如：
1 反相柱 分别用甲醇:水=90:10，纯甲醇(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)等溶剂作为流动相，依次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的色谱柱体积.然后再以相反的次序冲洗。
2 正相柱 分别用正己烷(HPLC级)，异丙醇(HPLC级)，二氯甲烷(HPLC级)，甲醇(HPLC级)等溶剂做流动相，顺次冲洗，每种流动相流经色谱柱不少于20倍的柱体积(异丙醇粘度大，可降低流速，避免压力过高).注意使用溶剂的次序不要颠倒，用甲醇冲洗完后，再以相反的次序冲洗至正己烷，所有的流动相必须严格脱水。
3 离子交换柱 长时间在缓冲溶液中使用和进样，将导致色谱柱离子交换能力下降，用稀酸缓冲溶液冲洗可以使阳离子柱再生，反之，用稀碱缓冲溶液冲洗可以使阴离子柱再生。
另外，还可以选择能溶解柱内污染物的溶剂为流动相做正方向和反方向冲洗。但再生后的色谱柱柱效是不可能恢复到新柱的水平的.如果柱子装反了，可以调回来，但可能会造成柱内担体塌陷.在不得已的情况下尽量不要反装色谱柱。
